什么是膜片钳技术？膜片钳的本质属于电压钳的范畴。电压钳（voltage—clamp）技术由美国学者Cole提出，英国学者Hodgkin、Huxley和Katz进一步发展而成，其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，使膜电位稳定在指令电压水平，以消除钠电导对膜电位的正反馈效应，这样，在膜电位突然跃变并固定于某一数值时，可观察膜电流的变化。 膜片钳技术的基本原理是利用一个尖端直径约1.5~3.0μm的锥状玻璃管（微电极），通过负压吸引使尖端

1、细胞准备 （1）取出生长状态良好的细胞，弃培养基，消化重悬细胞。 （2）将24孔圆形爬片放入24孔板的孔中。 （3）根据细胞生长特性取适量细胞于已铺爬片的24孔板中，放入37℃孵箱培养。 2、固定 （1）取出细胞，弃去培养基，用PBS洗细胞3次。 （2）每孔加入1mL的4%多聚甲醛，室温固定10-20min，弃去多聚甲醛； （3）加入1mL的PBS清洗细胞，重复两次。 3、通透 （1）每孔加入1mL的0.5% Triton-X100 ，室温10min，弃去Triton-X100。 （2）加入1mL的PBS清洗细胞，5m

关键技巧 一、颠覆认知的三大法则 1. 湿润度：成败关键 • 正确标准：海绵轻捏后呈连续液滴渗出 • 过湿警示：电流紊乱导致膜面"陨石坑" • 处理技巧：使用吸水纸精准调控湿度 2. 分子量与时间悖论 • 修正公式：>80kDa蛋白，每增加50kDa减少10%转膜时间 • 物理机制：大分子在电场中迁移速率更快 • 验证方法：转膜30分钟后丽春红染色定位 3. 甲醇浓度红线 • 致命阈值：>20%甲醇导致<15kDa蛋白漏失 • 特殊处理：磷酸化蛋白实验降至15%