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抗体筛选鉴定推荐流程

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抗体筛选鉴定推荐流程:
1.包被免疫管:将100ug 抗体加入到2mL PBS中并加入到免疫管中,4度过夜孵育。
2.封闭:将扩增和纯化噬菌体文库后的噬菌体 500ul 加入到1mL 3% BSA中,室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA,室温旋转孵育2h。
3.抗原和噬菌体孵育:将封闭后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗3次,每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中,添加PBS直至2-3mL,室温旋转孵育1h。
4.清洗:将抗原和噬菌体孵育后的免疫管用含有0.01%吐温的PBS洗20次,每次5分钟。
5.洗脱:往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime,室温孵育10分钟,加入1M Tris-HCl中和Trimethymime,将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。
将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库 扩增后再重复筛选过程2次,逐次减半包被免疫管的抗体量,得到3次筛选后的洗脱噬菌体。
6.ELISA鉴定:将上一步筛选得到的噬菌体稀释10^6倍后,取100ul加入到OD600为0.5的SS320菌液中,37度培养30分钟后涂布含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养板上,37度过夜培养第二天得到单克隆菌落。
挑选96个单克隆菌落到含有四环素和氨苄霉素的2X YT培养液的96孔细胞培养板上,37度培养3-4小时后往培养孔中加入卡那霉素和20:1的辅助噬菌体,30度过夜培养。第二天将过夜培养后的细胞液离心,获得上清液。
将过夜包被抗原和用3%BSA封闭过后的96孔ELISA板中加入上一步获得的噬菌体上清液,室温孵育1h。用含有0.05%吐温的PBS清洗3次后,用噬菌体抗体抗体作为一抗,用相应的二抗TMB显色后在波长450读取每个孔的吸光值。选取吸光值读数最高的SS320菌落送去测序,得到抗体的基因序列。
抗体筛选技巧:
1. 合适量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水亲水性质、结构有关,也和包被缓冲液和包被介质的选择有关,合理的包被是成功筛选的基础,如果有必要可以进行预实验确定包被的条件。
2. 洗脱后测定噬菌体的效价,经过2-4轮包被后筛选的富集程度需要在合理范围之内。


1楼2020-04-21 13:30回复
    Max Helper Phage 是通过改造M13KO7使其pIII基因缺失获得( M13 K07ΔpIII ), 由产生功能性pIII的大肠杆菌包装细胞系产生, 所得的超噬菌体在其表面携带功能性pIII,但在其基因组中缺少pIII基因。
    由于没有pIII基因, 当使用Max Helper Phage建立噬菌体文库时,产生的噬菌体必须使用phagemid vector上的pIII融合蛋白,所以包装出来的phage都展示有目的蛋白,不会出现空载。每个所得的噬菌体表面上能展示几个拷贝的抗体或肽,Max Helper Phage通过增加每个噬菌体颗粒显示的抗体数量(高达5对0.01),从而在功能基因分析和蛋白质组学领域提供了很大的优势,从而改善噬菌体展示中的抗体呈递。噬菌体的淘选可以用少量的抗原进行,效率更高。


    2楼2020-08-15 11:03
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