在进行免疫荧光实验时，常见的问题包括：背景漆黑、光点散乱、高背景染色及模糊，目标蛋白荧光微弱且组间差异不显著，以及荧光过强导致的非特异性标记。其实针对这些问题解决起来并不难，我们可以从以下几个方面着手优化：
一、优化灌流取材
拍摄时发现的血管状非特异性染色，往往源于灌流不彻底，动物体内血液残留。以小鼠心脏灌流为例，应先用预冷1×PBS彻底灌流至血液排尽，再灌注4%多聚甲醛溶液至小鼠僵直。随后，将组织置于4℃的4%多聚甲醛溶液中固定约1小时，1×PBS清洗5次，每次30分钟，最后以25%蔗糖溶液脱水约12小时后包埋。脱水步骤至关重要，不可忽视。
二、调整抗原修复
常规使用pH约6.0的柠檬酸盐溶液，虽对多数抗原有效，但也有实验需调至偏碱性（约pH 8.0）以促进特异性抗体-抗原结合。因此，抗原修复液的选择应基于实验具体需求，而非盲目遵循传统方案，适合自身实验的才是最佳选择。
三、确保溶液纯净
当片子出现异常亮点时，需考虑洗片溶液是否含有结晶等杂质。建议过滤溶液，并加大摇床力度清洗片子，特别是荧光二抗孵育后，必须彻底清洗以避免非特异性染色。使用荧光防淬灭封片剂时，注意避免吸取其结晶部分。
四、增强目标蛋白荧光
若目标蛋白荧光弱或组间差异不明显，首先确认抗体是否适用于预处理组织，如某些抗体仅适用于冰冻切片而非石蜡切片。查阅文献了解目标蛋白在组织或细胞中的表达水平，可能该蛋白本身表达量低。此外，抗体修复不充分也会导致弱标记，需根据抗体说明书，在适宜的酸碱环境中进行修复，确保抗原表位完全暴露。
五、目标蛋白荧光过强时，易导致背景染色误判为阳性
此现象多因抗体浓度过高且漂洗不足，使得多余抗体附着于组织，引发整体荧光背景升高。解决之道在于适度降低一抗或二抗浓度，并延长漂洗时间。
六、细胞核染色时，需谨慎控制DAPI试剂用量
当前常用的防荧光衰减DAPI，仅需一滴即可标记细胞核。过量添加则会导致整个图像呈现蓝色背景。因此，实验时应确保DAPI仅覆盖薄薄一层。
七、组织切片预处理至关重要
石蜡切片等若脱蜡不彻底，易产生区域性非特异性标记。建议彻底脱蜡，并在脱蜡前充分烤片以辅助脱蜡。实验过程中，玻片干燥同样会引发高背景或非特异性标记，尤其在漂洗和抗体孵育环节。大批量实验时更需警惕，可使用免疫组化专用笔圈定区域，有效防止干片。
八、图像采集需迅速
长时间将激发光对准目标区域，会加速该区域荧光衰减。因此，当目标区域较小时，应尽可能快速采集，以减少实验误差。