01
透射电镜概述
1、基本原理
透射电镜的成像机制涉及电子枪发射的高速电子束，该束流经由1~2级聚光镜聚焦后，均匀投射至样品待观测的微小区域。电子与样品间发生碰撞及非碰撞作用，鉴于电子穿透力有限，样品需极薄以确保电子穿透。穿透样品的电子，其强度分布直接反映样品区域的形态、组织及结构特征。这些电子随后通过物镜、中间镜及投影镜三级磁透镜系统放大，并投射至荧光屏上。荧光屏将电子强度转换为可见光强分布，从而呈现出与样品形态、组织、结构相对应的图像，供观察者分析。
2、应用范围
生物透射电镜作为探究超微结构的得力助手，能够清晰展现细胞及其亚结构的全貌。针对生物细胞样品，推荐使用电压范围在80-120kv的生物专用透射电镜，以有效减轻高能电子束对样品的辐射损伤。
结合生物样品制备技术的进步，如超薄切片、负染色、冷冻制样及细胞化学技术等，生物透射电镜在组织学、细胞学、病毒学、病理学及材料学等领域得到广泛应用。它常被用于观察细胞整体形态、细胞膜与细胞壁及细胞器的变化、材料在细胞内的分布、细胞应对外界刺激形成的自噬小体，以及外源生物入侵的侵染结构等。
02
生物透射电镜样本制作流程
生物透射电镜的常规样本制备包含六大步骤：取材、固定、脱水、包埋（含渗透、包埋、聚合）、超薄切片及电子染色。以下是对各步骤关键点的简述。
1、取材
取材需遵循快、小、冷、准的原则，并避免机械损伤。快速取材后应立即放入固定液以防结构改变；取材组织应小，以确保固定液能充分渗透；操作需在低温下进行，所有物品需预冷；取材位置需精确；同时，要避免对组织造成挤压等损伤。
2、固定
固定旨在保护样本结构，使其在后续处理中不受破坏，呈现原始形态。固定液由固定剂和缓冲液配制，缓冲液能模拟细胞外液，维持稳定的pH值和渗透压。常用固定剂包括：（1）戊二醛，最常用，能保护蛋白质和酶活性，无电子染色作用；（2）多聚甲醛，能保存酶活性，常用于细胞化学研究；（3）饿酸，能固定脂类和膜结构，具有一定的电子染色作用。通常采用双固定法，即先用戊二醛前固定，漂洗后再用饿酸后固定。
3、脱水处理
为确保包埋剂能充分渗透组织，必须执行彻底的脱水步骤。常用的脱水剂包括酒精、丙酮和环氧丙烷。脱水需既彻底又高效，避免时间过长，且固定后的样品需充分漂洗。通常采用逐级梯度脱水法，例如依次浸泡于浓度为30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精中，每次浸泡时间大约为10-20分钟，最后以100%丙酮浸泡收尾。（需注意的是，此方法及浓度并非一成不变，应根据具体材料灵活调整。）
4、包埋
包埋过程主要分为渗透、包埋和聚合三个阶段。
操作时应注意以下几点：
（1）配制包埋剂时，需确保其软硬度可调，便于渗透；
（2）包埋过程中要防止气泡产生；
（3）聚合时的温度应尽可能保持低温。
5、超薄切片制备
超薄切片的制备流程主要包括装块、装刀、对刀、加水、切片及捞片。常用的切片刀有玻璃刀或钻石刀，刀上需装配水槽，并注入新鲜槽液，如二甲基亚砜(DMSO)或甘油水溶液，同时确保水槽密封，以防漏水。
操作时需注意：
（1）使用新鲜槽液，确保其与材料不发生反应，且液面应与刀口基本保持平行；
（2）严格密封刀槽，避免漏水；
（3）维持适宜的温度和湿度，通常分别为约25℃和约60%。
6、电子染色处理
超薄切片的电子染色是基于重金属离子对不同细胞结构的结合能力差异，使细胞内各结构对电子产生强散射，从而增强对比度。常用的染色液包括铀盐和铅盐。为获得最佳对比度，通常采用铀盐和铅盐复合染色法，即先染铀后染铅。常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅，它们既可单独使用也可组合使用，其中双染色法最为常用。
03
透射电镜常见样品的要求
鉴于生物透射电镜操作的技巧性，许多实验室倾向于外包此服务。在送样外包前，对标本的预处理至关重要。以下概述了组织样本与细胞样本两种常见类型的处理方法。
1、组织样本处理：
在1-3分钟内迅速取样，样本尺寸控制在2mmX2mm，尽量薄。若无法立即修整至合适大小，可先置于2.5%戊二醛固定液中固定约半小时，待组织变硬后再进行修整。
取材时需精确瞄准目标观察部位（例如，观察肾小球则取肾皮质；观察胰岛则取胰尾丰富区域；对于皮肤、肠胃等易在固定液中卷曲的组织，可粘贴于滤纸上进行固定）。
取材过程中务必小心，避免使用镊子挤压等造成机械损伤，确保刀片锋利，以防挫伤组织。
组织取下后，立即浸入2.5%戊二醛固定液中，室温避光固定2小时，随后转移至4°C环境保存，并使用冰袋运输。注意，在保存和运输过程中，固定液不得冷冻结冰。在4°C条件下，样本可保存约1个月，不宜长时间存放。
2、细胞样本处理
（1）贴壁细胞：
对于培养好的细胞（通常要求细胞量达到10^6以上），首先弃去培养基，然后加入2.5%的常温戊二醛固定液。
在常温条件下避光固定约5分钟，之后使用细胞刮沿同一方向轻轻刮下细胞。
利用巴氏吸管将细胞液吸入离心管，放入离心机中（转速不超过3000转），离心约2分钟，直至形成绿豆大小的细胞团。
弃去原固定液，加入新的电镜固定液，轻轻挑起细胞团，使其悬浮于固定液中。
在室温下避光固定30分钟，随后转移至4°C环境保存，并使用冰袋运输。在此过程中，务必确保固定液不冷冻结冰。
（2）悬浮细胞：
对于悬浮细胞，通过离心收集至肉眼可见绿豆大小的细胞沉淀。弃去培养基后，加入电镜固定液，在室温下避光固定2小时。之后同样转移至4°C保存，并使用冰袋运输，期间需确保固定液不冷冻结冰。
透射电镜概述
1、基本原理
透射电镜的成像机制涉及电子枪发射的高速电子束，该束流经由1~2级聚光镜聚焦后，均匀投射至样品待观测的微小区域。电子与样品间发生碰撞及非碰撞作用，鉴于电子穿透力有限，样品需极薄以确保电子穿透。穿透样品的电子，其强度分布直接反映样品区域的形态、组织及结构特征。这些电子随后通过物镜、中间镜及投影镜三级磁透镜系统放大，并投射至荧光屏上。荧光屏将电子强度转换为可见光强分布，从而呈现出与样品形态、组织、结构相对应的图像，供观察者分析。
2、应用范围
生物透射电镜作为探究超微结构的得力助手，能够清晰展现细胞及其亚结构的全貌。针对生物细胞样品，推荐使用电压范围在80-120kv的生物专用透射电镜，以有效减轻高能电子束对样品的辐射损伤。
结合生物样品制备技术的进步，如超薄切片、负染色、冷冻制样及细胞化学技术等，生物透射电镜在组织学、细胞学、病毒学、病理学及材料学等领域得到广泛应用。它常被用于观察细胞整体形态、细胞膜与细胞壁及细胞器的变化、材料在细胞内的分布、细胞应对外界刺激形成的自噬小体，以及外源生物入侵的侵染结构等。
02
生物透射电镜样本制作流程
生物透射电镜的常规样本制备包含六大步骤：取材、固定、脱水、包埋（含渗透、包埋、聚合）、超薄切片及电子染色。以下是对各步骤关键点的简述。
1、取材
取材需遵循快、小、冷、准的原则，并避免机械损伤。快速取材后应立即放入固定液以防结构改变；取材组织应小，以确保固定液能充分渗透；操作需在低温下进行，所有物品需预冷；取材位置需精确；同时，要避免对组织造成挤压等损伤。
2、固定
固定旨在保护样本结构，使其在后续处理中不受破坏，呈现原始形态。固定液由固定剂和缓冲液配制，缓冲液能模拟细胞外液，维持稳定的pH值和渗透压。常用固定剂包括：（1）戊二醛，最常用，能保护蛋白质和酶活性，无电子染色作用；（2）多聚甲醛，能保存酶活性，常用于细胞化学研究；（3）饿酸，能固定脂类和膜结构，具有一定的电子染色作用。通常采用双固定法，即先用戊二醛前固定，漂洗后再用饿酸后固定。
3、脱水处理
为确保包埋剂能充分渗透组织，必须执行彻底的脱水步骤。常用的脱水剂包括酒精、丙酮和环氧丙烷。脱水需既彻底又高效，避免时间过长，且固定后的样品需充分漂洗。通常采用逐级梯度脱水法，例如依次浸泡于浓度为30%、50%、70%、80%、90%、100%的酒精中，每次浸泡时间大约为10-20分钟，最后以100%丙酮浸泡收尾。（需注意的是，此方法及浓度并非一成不变，应根据具体材料灵活调整。）
4、包埋
包埋过程主要分为渗透、包埋和聚合三个阶段。
操作时应注意以下几点：
（1）配制包埋剂时，需确保其软硬度可调，便于渗透；
（2）包埋过程中要防止气泡产生；
（3）聚合时的温度应尽可能保持低温。
5、超薄切片制备
超薄切片的制备流程主要包括装块、装刀、对刀、加水、切片及捞片。常用的切片刀有玻璃刀或钻石刀，刀上需装配水槽，并注入新鲜槽液，如二甲基亚砜(DMSO)或甘油水溶液，同时确保水槽密封，以防漏水。
操作时需注意：
（1）使用新鲜槽液，确保其与材料不发生反应，且液面应与刀口基本保持平行；
（2）严格密封刀槽，避免漏水；
（3）维持适宜的温度和湿度，通常分别为约25℃和约60%。
6、电子染色处理
超薄切片的电子染色是基于重金属离子对不同细胞结构的结合能力差异，使细胞内各结构对电子产生强散射，从而增强对比度。常用的染色液包括铀盐和铅盐。为获得最佳对比度，通常采用铀盐和铅盐复合染色法，即先染铀后染铅。常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅，它们既可单独使用也可组合使用，其中双染色法最为常用。
03
透射电镜常见样品的要求
鉴于生物透射电镜操作的技巧性，许多实验室倾向于外包此服务。在送样外包前，对标本的预处理至关重要。以下概述了组织样本与细胞样本两种常见类型的处理方法。
1、组织样本处理：
在1-3分钟内迅速取样，样本尺寸控制在2mmX2mm，尽量薄。若无法立即修整至合适大小，可先置于2.5%戊二醛固定液中固定约半小时，待组织变硬后再进行修整。
取材时需精确瞄准目标观察部位（例如，观察肾小球则取肾皮质；观察胰岛则取胰尾丰富区域；对于皮肤、肠胃等易在固定液中卷曲的组织，可粘贴于滤纸上进行固定）。
取材过程中务必小心，避免使用镊子挤压等造成机械损伤，确保刀片锋利，以防挫伤组织。
组织取下后，立即浸入2.5%戊二醛固定液中，室温避光固定2小时，随后转移至4°C环境保存，并使用冰袋运输。注意，在保存和运输过程中，固定液不得冷冻结冰。在4°C条件下，样本可保存约1个月，不宜长时间存放。
2、细胞样本处理
（1）贴壁细胞：
对于培养好的细胞（通常要求细胞量达到10^6以上），首先弃去培养基，然后加入2.5%的常温戊二醛固定液。
在常温条件下避光固定约5分钟，之后使用细胞刮沿同一方向轻轻刮下细胞。
利用巴氏吸管将细胞液吸入离心管，放入离心机中（转速不超过3000转），离心约2分钟，直至形成绿豆大小的细胞团。
弃去原固定液，加入新的电镜固定液，轻轻挑起细胞团，使其悬浮于固定液中。
在室温下避光固定30分钟，随后转移至4°C环境保存，并使用冰袋运输。在此过程中，务必确保固定液不冷冻结冰。
（2）悬浮细胞：
对于悬浮细胞，通过离心收集至肉眼可见绿豆大小的细胞沉淀。弃去培养基后，加入电镜固定液，在室温下避光固定2小时。之后同样转移至4°C保存，并使用冰袋运输，期间需确保固定液不冷冻结冰。
