免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术是一种强大的生物学工具，它利用荧光标记的抗体来精确定位和定性分析组织或细胞内的特定抗原。在细胞生物学研究中，细胞免疫荧光染色尤为常见，它能够帮助科学家们深入了解细胞内部的结构和功能。接下来，我们将详细介绍细胞爬片免疫荧光实验的操作步骤及一些小技巧。
实验器材及试剂
• 仪器和耗材：洁净工作台、CO2恒温培养箱、涡旋混合器、移液枪、正置荧光显微镜、成像系统。
• 试剂：4%多聚甲醛、破膜剂（如0.5% Triton X-100）、载玻片、盖玻片、PBS缓冲液、BSA（牛血清白蛋白）、一抗、荧光二抗、组化笔、抗体稀释液、DAPI染液、抗荧光淬灭封片剂。
细胞爬片免疫荧光实验操作步骤
1. 细胞培养：
• 在超净工作台内，将灭菌盖玻片放置于六孔板中。
• 将细胞悬液滴加至盖玻片上，然后置于CO2浓度为5%的培养箱中，于37℃培养至细胞固着（约2小时）。
• 加入2mL细胞培养液，继续培养约6小时。
• 倒去培养基，用PBS洗涤3次，每次5分钟。
2. 细胞固定：
• 使用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
3. 细胞破膜：
• 爬片稍甩干后，用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈，以防止抗体流走。
• 加入50-100μL破膜工作液（如0.5% Triton X-100），室温孵育10分钟。
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
4. 血清封闭：
• 在圈内滴加BSA，孵育30分钟，以封闭非特异性结合位点。
5. 加一抗：
• 轻轻甩掉封闭液，在细胞孔板里滴加按比例配好的一抗。
• 将平放于湿盒内，4°C孵育过夜。
6. 加二抗：
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
• 在圈内滴加与一抗相应种属的二抗，覆盖组织。
• 避光室温孵育50分钟。
7. DAPI复染细胞核：
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
• 在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10分钟。
8. 封片：
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
• 爬片稍甩干后，将有细胞的一面朝下，用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载玻片上。
9. 镜检拍照：
• 切片于荧光显微镜下或共聚焦下观察并采集图像。
• 根据不同的荧光素选择适当的激发波长和发射波长。
10. 结果判读：
• DAPI染出的细胞核在紫外激发下为蓝色。
• 阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿光。
实验小技巧
1. 封闭剂选择：选择与二抗种属来源相同的血清进行封闭，以减少非特异性结合。
2. 封闭时间：封闭时间不宜过长，30-60分钟即可。封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育。
3. 一抗孵育：4°C过夜孵育一抗，可以使抗原抗体结合更加充分。
4. 一抗选择：考虑抗原名称、反应性和应用场景，选择最合适的一抗。
5. 二抗选择：根据一抗的种属来源、亚型和荧光标记来选择二抗。注意避免荧光素之间的串色。
6. 抗体稀释：一抗和二抗的稀释比例可以根据抗体说明书进行，并结合自己的实验要求进行优化。
7. 双标染色：如果进行双标染色，要确保两种蛋白的抗体来源种属和二抗的荧光素都区分开。
8. 洗涤过程：洗涤时要轻柔，避免细胞脱落；洗涤时间要适中，每次约5分钟；切忌干片，以防止背景过高。
实验器材及试剂
• 仪器和耗材：洁净工作台、CO2恒温培养箱、涡旋混合器、移液枪、正置荧光显微镜、成像系统。
• 试剂：4%多聚甲醛、破膜剂（如0.5% Triton X-100）、载玻片、盖玻片、PBS缓冲液、BSA（牛血清白蛋白）、一抗、荧光二抗、组化笔、抗体稀释液、DAPI染液、抗荧光淬灭封片剂。
细胞爬片免疫荧光实验操作步骤
1. 细胞培养：
• 在超净工作台内，将灭菌盖玻片放置于六孔板中。
• 将细胞悬液滴加至盖玻片上，然后置于CO2浓度为5%的培养箱中，于37℃培养至细胞固着（约2小时）。
• 加入2mL细胞培养液，继续培养约6小时。
• 倒去培养基，用PBS洗涤3次，每次5分钟。
2. 细胞固定：
• 使用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
3. 细胞破膜：
• 爬片稍甩干后，用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈，以防止抗体流走。
• 加入50-100μL破膜工作液（如0.5% Triton X-100），室温孵育10分钟。
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
4. 血清封闭：
• 在圈内滴加BSA，孵育30分钟，以封闭非特异性结合位点。
5. 加一抗：
• 轻轻甩掉封闭液，在细胞孔板里滴加按比例配好的一抗。
• 将平放于湿盒内，4°C孵育过夜。
6. 加二抗：
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
• 在圈内滴加与一抗相应种属的二抗，覆盖组织。
• 避光室温孵育50分钟。
7. DAPI复染细胞核：
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
• 在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10分钟。
8. 封片：
• 用PBS洗涤3次，每次5分钟。
• 爬片稍甩干后，将有细胞的一面朝下，用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载玻片上。
9. 镜检拍照：
• 切片于荧光显微镜下或共聚焦下观察并采集图像。
• 根据不同的荧光素选择适当的激发波长和发射波长。
10. 结果判读：
• DAPI染出的细胞核在紫外激发下为蓝色。
• 阳性表达为相应荧光素标记的红光或绿光。
实验小技巧
1. 封闭剂选择：选择与二抗种属来源相同的血清进行封闭，以减少非特异性结合。
2. 封闭时间：封闭时间不宜过长，30-60分钟即可。封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育。
3. 一抗孵育：4°C过夜孵育一抗，可以使抗原抗体结合更加充分。
4. 一抗选择：考虑抗原名称、反应性和应用场景，选择最合适的一抗。
5. 二抗选择：根据一抗的种属来源、亚型和荧光标记来选择二抗。注意避免荧光素之间的串色。
6. 抗体稀释：一抗和二抗的稀释比例可以根据抗体说明书进行，并结合自己的实验要求进行优化。
7. 双标染色：如果进行双标染色，要确保两种蛋白的抗体来源种属和二抗的荧光素都区分开。
8. 洗涤过程：洗涤时要轻柔，避免细胞脱落；洗涤时间要适中，每次约5分钟；切忌干片，以防止背景过高。
