一、实验前期筹备
在进行细胞传代之前，有几项关键的预备工作需要完成：
1. 预热试剂：首先，将配置完毕的培养液、PBS溶液以及胰蛋白酶瓶置于37°C的水浴锅中进行预热。这一步骤对于确保细胞在最佳温度下生长至关重要。
2. 消毒处理：接下来，使用75%浓度的酒精对经过紫外线消毒的超净工作台以及操作者的双手进行彻底擦拭，以减少实验过程中的微生物污染，确保实验环境的纯净。
3. 器械布置：合理摆放实验所需器械，确保操作空间充足，既便于实验操作，又能有效降低污染风险，从而提升实验的精确性和可重复性。
4. 点燃酒精灯：点燃酒精灯，并确保火焰保持适中，以便为实验中的消毒和灼烧操作提供稳定的热源。良好的前期准备是细胞培养实验成功的基础，它直接关系到实验结果的准确性和可靠性。
二、细胞传代流程
1. 准备培养液：从预热装置中取出培养液，用酒精棉球仔细擦拭外壁后，放置于超净工作台内备用。
2. 取出细胞：从培养箱中小心取出装有细胞的培养瓶，注意旋紧瓶盖以防止污染。在观察细胞前，需用酒精棉球清洁显微镜的工作台面。
3. 转移与消毒：将培养瓶移至超净工作台内，打开瓶盖，并在酒精灯火焰上短暂灼烧瓶口以消毒。
4. 添加消化剂：轻轻吸去旧培养液，用PBS溶液清洗后，加入适量的消化剂（如胰蛋白酶）以促进细胞分离。
5. 观察消化情况：使用倒置显微镜观察细胞状态。当细胞边缘变得清晰，不再紧密连接时，即表示消化适度。
6. 终止消化：弃去胰蛋白酶液，加入新的培养液以中和消化作用，并轻轻吹打使细胞悬浮。
7. 离心处理：将细胞悬液转移至10毫升离心管中，平衡后置于离心机中，以1000转/分钟的速度离心5分钟。
8. 制备悬液：离心后弃去上清液，加入适量培养液，轻轻吹打制成细胞悬液。
9. 分装培养：将细胞悬液均匀分配至2-3个新的培养瓶中，补充培养基后旋紧瓶盖。
10. 继续培养：将培养瓶放入培养箱中，传代后的细胞将在2-4小时内开始贴壁生长。
三、操作要点提示
1. 严格无菌操作：在整个实验过程中，必须严格遵守无菌操作规程，确保所有操作均在无菌环境下进行。
2. 监控消化过程：消化时间受多种因素影响，包括消化剂种类、配制时间及其用量等。因此，需密切观察细胞形态变化，一旦发现细胞开始分离或浮起，应立即停止消化。
3. 合理布局器械：正确摆放实验器械，保持操作空间宽敞，不仅有助于提高操作效率，还能进一步降低污染风险。
在进行细胞传代之前，有几项关键的预备工作需要完成：
1. 预热试剂：首先，将配置完毕的培养液、PBS溶液以及胰蛋白酶瓶置于37°C的水浴锅中进行预热。这一步骤对于确保细胞在最佳温度下生长至关重要。
2. 消毒处理：接下来，使用75%浓度的酒精对经过紫外线消毒的超净工作台以及操作者的双手进行彻底擦拭，以减少实验过程中的微生物污染，确保实验环境的纯净。
3. 器械布置：合理摆放实验所需器械，确保操作空间充足，既便于实验操作，又能有效降低污染风险，从而提升实验的精确性和可重复性。
4. 点燃酒精灯：点燃酒精灯，并确保火焰保持适中，以便为实验中的消毒和灼烧操作提供稳定的热源。良好的前期准备是细胞培养实验成功的基础，它直接关系到实验结果的准确性和可靠性。
二、细胞传代流程
1. 准备培养液：从预热装置中取出培养液，用酒精棉球仔细擦拭外壁后，放置于超净工作台内备用。
2. 取出细胞：从培养箱中小心取出装有细胞的培养瓶，注意旋紧瓶盖以防止污染。在观察细胞前，需用酒精棉球清洁显微镜的工作台面。
3. 转移与消毒：将培养瓶移至超净工作台内，打开瓶盖，并在酒精灯火焰上短暂灼烧瓶口以消毒。
4. 添加消化剂：轻轻吸去旧培养液，用PBS溶液清洗后，加入适量的消化剂（如胰蛋白酶）以促进细胞分离。
5. 观察消化情况：使用倒置显微镜观察细胞状态。当细胞边缘变得清晰，不再紧密连接时，即表示消化适度。
6. 终止消化：弃去胰蛋白酶液，加入新的培养液以中和消化作用，并轻轻吹打使细胞悬浮。
7. 离心处理：将细胞悬液转移至10毫升离心管中，平衡后置于离心机中，以1000转/分钟的速度离心5分钟。
8. 制备悬液：离心后弃去上清液，加入适量培养液，轻轻吹打制成细胞悬液。
9. 分装培养：将细胞悬液均匀分配至2-3个新的培养瓶中，补充培养基后旋紧瓶盖。
10. 继续培养：将培养瓶放入培养箱中，传代后的细胞将在2-4小时内开始贴壁生长。
三、操作要点提示
1. 严格无菌操作：在整个实验过程中，必须严格遵守无菌操作规程，确保所有操作均在无菌环境下进行。
2. 监控消化过程：消化时间受多种因素影响，包括消化剂种类、配制时间及其用量等。因此，需密切观察细胞形态变化，一旦发现细胞开始分离或浮起，应立即停止消化。
3. 合理布局器械：正确摆放实验器械，保持操作空间宽敞，不仅有助于提高操作效率，还能进一步降低污染风险。
