经过长时间的摸索与实践，Western Blot实验的过程虽曲折，但实则掌握其要领后并不复杂。我归纳了在进行WB实验时可能遭遇的难题，并剖析了潜在的诱因及相应的应对策略，期望能为你的实验成功奠定坚实基础。
常见问题及其应对策略：问题一
转膜效果欠佳
1. 膜浸润不均
• 采用纯甲醇充分浸润膜材料。
2. 目标蛋白分子量偏小（<10kDa）
• 选用小孔径膜，并缩减转膜时长。
3. 目标蛋白等电点与转移缓冲液pH值相近或一致
• 尝试替换为其他缓冲体系，如CAPS缓冲液（pH 10.5），或采用低pH值的乙酸缓冲液。
4. 甲醇浓度偏高
• 降低甲醇比例，或考虑以乙醇、异丙醇作为替代。
5. 转膜时间不足
• 对于较厚的凝胶及高分子量蛋白，需适当延长转膜时间。
问题二
背景信号强烈
1. 膜浸润不均（同上）
2. 洗膜不彻底
• 增大洗液量，并增加洗涤次数。
3. 封闭效果不足
• 延长封闭液孵育时长，或提高孵育温度。同时，选用适宜的封闭剂（如脱脂乳粉、BSA、酪蛋白等）。
4. 二抗浓度偏高
• 适当降低二抗的使用浓度。
5. 反应过程中膜变干
• 确保反应液充足，防止膜干燥。
6. 曝光时间过长
• 缩短曝光时间以避免过度曝光。
7. 抗体与封闭蛋白存在交叉反应
• 验证抗体的特异性，选择无交叉反应的封闭剂，并在洗涤液中加入Tween-20以减少非特异性结合。
问题三
无阳性条带显现
1. 抗体染色不足
• 提高抗体浓度，并延长孵育时间。
2. 酶失活
• 通过直接混合酶与底物进行活性检测，若不显色则表明酶已失活。需选用有效期内且活性良好的酶联物。
3. 样本中靶蛋白缺失或含量过低
• 设置阳性对照以验证。若阳性对照有结果而样本无，则可能样本中靶蛋白含量不足。此时可考虑增加样本上样量。
4. 试剂不匹配问题
• 验证一抗与组织种属、一抗与二抗以及底物与酶系统之间的匹配性。通过设立内参照来确认二级检测系统的有效性。
5. 一抗失效
• 选用有效期内的一抗，并现配现用工作液。
6. 存在HRP抑制剂
• 确保所有溶液及容器中不含叠氮化钠等抑制剂。
问题四
阳性条带显现但信号较弱
1. 洗膜过度
• 缩短洗涤时间以避免洗去过多信号。
2. 抗体活性降低
• 选用有效期内的新鲜抗体，并现配现用工作液以避免长时间放置导致的活性降低。
3. 封闭过度
• 减少封闭剂的使用量或缩短封闭时间；尝试更换不同类型的封闭剂。
4. 曝光时间不足
• 适当延长曝光时间以增强信号显现。
问题五
条带位置异常或出现非特异性条带
1. 二抗非特异性结合
• 增设对照实验（不加一抗，其余操作相同）以验证背景是否源自二抗系统。选择特异性更强的二抗（如仅针对重链的二抗）。
2. 一抗特异性不足
• 使用单克隆抗体或亲和纯化抗体以提高特异性。
3. 蛋白降解
• 使用新鲜制备的样本，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。
4. 二聚体或多聚体存在
• 加强蛋白质变性处理及强度。
5. 抗体浓度过高导致非特异性结合增加
• 降低一抗和二抗的使用浓度以减少非特异性条带的出现。
6. 蛋白上样量过大导致条带重叠或模糊
• 适当减少上样量以获得更清晰的条带分离效果。
问题六
背景出现斑点状干扰
1. 封闭剂中含有聚集体导致背景不均一
• 在使用前对封闭剂进行过滤处理以去除聚集体。
2. HRP耦联二抗中存在聚集体影响结果准确性
• 对二抗试剂进行过滤处理以去除其中的聚集体，确保实验结果的准确性。
常见问题及其应对策略：问题一
转膜效果欠佳
1. 膜浸润不均
• 采用纯甲醇充分浸润膜材料。
2. 目标蛋白分子量偏小（<10kDa）
• 选用小孔径膜，并缩减转膜时长。
3. 目标蛋白等电点与转移缓冲液pH值相近或一致
• 尝试替换为其他缓冲体系，如CAPS缓冲液（pH 10.5），或采用低pH值的乙酸缓冲液。
4. 甲醇浓度偏高
• 降低甲醇比例，或考虑以乙醇、异丙醇作为替代。
5. 转膜时间不足
• 对于较厚的凝胶及高分子量蛋白，需适当延长转膜时间。
问题二
背景信号强烈
1. 膜浸润不均（同上）
2. 洗膜不彻底
• 增大洗液量，并增加洗涤次数。
3. 封闭效果不足
• 延长封闭液孵育时长，或提高孵育温度。同时，选用适宜的封闭剂（如脱脂乳粉、BSA、酪蛋白等）。
4. 二抗浓度偏高
• 适当降低二抗的使用浓度。
5. 反应过程中膜变干
• 确保反应液充足，防止膜干燥。
6. 曝光时间过长
• 缩短曝光时间以避免过度曝光。
7. 抗体与封闭蛋白存在交叉反应
• 验证抗体的特异性，选择无交叉反应的封闭剂，并在洗涤液中加入Tween-20以减少非特异性结合。
问题三
无阳性条带显现
1. 抗体染色不足
• 提高抗体浓度，并延长孵育时间。
2. 酶失活
• 通过直接混合酶与底物进行活性检测，若不显色则表明酶已失活。需选用有效期内且活性良好的酶联物。
3. 样本中靶蛋白缺失或含量过低
• 设置阳性对照以验证。若阳性对照有结果而样本无，则可能样本中靶蛋白含量不足。此时可考虑增加样本上样量。
4. 试剂不匹配问题
• 验证一抗与组织种属、一抗与二抗以及底物与酶系统之间的匹配性。通过设立内参照来确认二级检测系统的有效性。
5. 一抗失效
• 选用有效期内的一抗，并现配现用工作液。
6. 存在HRP抑制剂
• 确保所有溶液及容器中不含叠氮化钠等抑制剂。
问题四
阳性条带显现但信号较弱
1. 洗膜过度
• 缩短洗涤时间以避免洗去过多信号。
2. 抗体活性降低
• 选用有效期内的新鲜抗体，并现配现用工作液以避免长时间放置导致的活性降低。
3. 封闭过度
• 减少封闭剂的使用量或缩短封闭时间；尝试更换不同类型的封闭剂。
4. 曝光时间不足
• 适当延长曝光时间以增强信号显现。
问题五
条带位置异常或出现非特异性条带
1. 二抗非特异性结合
• 增设对照实验（不加一抗，其余操作相同）以验证背景是否源自二抗系统。选择特异性更强的二抗（如仅针对重链的二抗）。
2. 一抗特异性不足
• 使用单克隆抗体或亲和纯化抗体以提高特异性。
3. 蛋白降解
• 使用新鲜制备的样本，并加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。
4. 二聚体或多聚体存在
• 加强蛋白质变性处理及强度。
5. 抗体浓度过高导致非特异性结合增加
• 降低一抗和二抗的使用浓度以减少非特异性条带的出现。
6. 蛋白上样量过大导致条带重叠或模糊
• 适当减少上样量以获得更清晰的条带分离效果。
问题六
背景出现斑点状干扰
1. 封闭剂中含有聚集体导致背景不均一
• 在使用前对封闭剂进行过滤处理以去除聚集体。
2. HRP耦联二抗中存在聚集体影响结果准确性
• 对二抗试剂进行过滤处理以去除其中的聚集体，确保实验结果的准确性。
