细胞瞬时转染是一种常用的实验技术，用于将外源DNA或RNA导入细胞内，从而研究基因的表达、功能和调控机制。以下是细胞瞬时转染的一般步骤和注意事项。
一、细胞瞬时转染的一般步骤
01细胞培养
• 提前一天铺板，确保细胞均匀分布。转染前将细胞培养至70-80%的密度，以保证细胞处于活跃的生长状态。
02转染试剂和质粒准备
• 根据转染试剂的说明书准备转染试剂和质粒DNA。转染试剂的用量通常根据细胞类型和转染效率来确定，一般为2-10μL/孔（对于24孔板）。质粒DNA的用量通常为0.1-1μg/孔（对于24孔板），具体用量需根据实验目的和转染效率进行优化。
03混合转染试剂和质粒
• 在无菌条件下，将转染试剂和质粒DNA混合在无血清培养基中。质粒和转染试剂混合后需用枪轻轻混匀，然后孵育5-30分钟，以形成转染复合物。
04转染复合物添加到细胞
• 将转染复合物添加到细胞培养孔中，轻轻摇动以确保均匀分布。
05孵育
• 将细胞培养板放回培养箱中，孵育一定时间（通常为24-48小时），以便DNA进入细胞并表达。
06观察和分析
• 根据实验目的，可以通过荧光显微镜观察转染效率，或通过提取蛋白质进行Western blot验证。
二、注意事项
01无菌操作
• 确保所有操作在无菌条件下进行，避免污染。
02转染条件优化
• 转染效率可能受到细胞类型、转染试剂、质粒DNA质量、转染条件等多种因素的影响，因此需要进行优化实验以确定最佳转染条件。
03细胞状态观察
• 转染后细胞可能会受到一定的应激，因此需要密切观察细胞状态，确保细胞健康生长。
04细胞密度控制
• 细胞密度对转染效率有重要影响。转染时细胞密度过高或过低都可能导致转染效率降低。因此，需要根据转染试剂和细胞类型调整最适细胞密度。
05质粒质量要求
• 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质、无内毒素、无RNA和其他化学物质的污染，且OD260/280比值应在1.8以上，以确保转染效率。
06培养基选择
• 在开始准备DNA和转染试剂稀释液时，应使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。同时，培养基中也不应含有抗生素，如青霉素和链霉素等，这些抗生素会降低细胞的活性，导致转染效率低。
三、影响细胞转染的因素
01细胞密度
• 不同的转染试剂和细胞类型对转染时的细胞密度有不同的要求。过高或过低的细胞密度都会影响转染效率。
02细胞生长状态
• 细胞的生长状态对转染效率也有重要影响。传代次数过多或过少、细胞状态不佳都可能导致细胞对转染试剂的敏感度降低。
03质粒质量
• 质粒DNA的质量和纯度直接影响转染效率。因此，在进行转染前需要对质粒进行严格的提取、纯化和质量检测。
04培养基成分
• 培养基中的血清和抗生素等成分可能会影响转染复合物的形成和细胞的活性，从而降低转染效率。因此，在转染过程中需要选择合适的培养基成分。
一、细胞瞬时转染的一般步骤
01细胞培养
• 提前一天铺板，确保细胞均匀分布。转染前将细胞培养至70-80%的密度，以保证细胞处于活跃的生长状态。
02转染试剂和质粒准备
• 根据转染试剂的说明书准备转染试剂和质粒DNA。转染试剂的用量通常根据细胞类型和转染效率来确定，一般为2-10μL/孔（对于24孔板）。质粒DNA的用量通常为0.1-1μg/孔（对于24孔板），具体用量需根据实验目的和转染效率进行优化。
03混合转染试剂和质粒
• 在无菌条件下，将转染试剂和质粒DNA混合在无血清培养基中。质粒和转染试剂混合后需用枪轻轻混匀，然后孵育5-30分钟，以形成转染复合物。
04转染复合物添加到细胞
• 将转染复合物添加到细胞培养孔中，轻轻摇动以确保均匀分布。
05孵育
• 将细胞培养板放回培养箱中，孵育一定时间（通常为24-48小时），以便DNA进入细胞并表达。
06观察和分析
• 根据实验目的，可以通过荧光显微镜观察转染效率，或通过提取蛋白质进行Western blot验证。
二、注意事项
01无菌操作
• 确保所有操作在无菌条件下进行，避免污染。
02转染条件优化
• 转染效率可能受到细胞类型、转染试剂、质粒DNA质量、转染条件等多种因素的影响，因此需要进行优化实验以确定最佳转染条件。
03细胞状态观察
• 转染后细胞可能会受到一定的应激，因此需要密切观察细胞状态，确保细胞健康生长。
04细胞密度控制
• 细胞密度对转染效率有重要影响。转染时细胞密度过高或过低都可能导致转染效率降低。因此，需要根据转染试剂和细胞类型调整最适细胞密度。
05质粒质量要求
• 用于转染的质粒DNA必须无蛋白质、无内毒素、无RNA和其他化学物质的污染，且OD260/280比值应在1.8以上，以确保转染效率。
06培养基选择
• 在开始准备DNA和转染试剂稀释液时，应使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。同时，培养基中也不应含有抗生素，如青霉素和链霉素等，这些抗生素会降低细胞的活性，导致转染效率低。
三、影响细胞转染的因素
01细胞密度
• 不同的转染试剂和细胞类型对转染时的细胞密度有不同的要求。过高或过低的细胞密度都会影响转染效率。
02细胞生长状态
• 细胞的生长状态对转染效率也有重要影响。传代次数过多或过少、细胞状态不佳都可能导致细胞对转染试剂的敏感度降低。
03质粒质量
• 质粒DNA的质量和纯度直接影响转染效率。因此，在进行转染前需要对质粒进行严格的提取、纯化和质量检测。
04培养基成分
• 培养基中的血清和抗生素等成分可能会影响转染复合物的形成和细胞的活性，从而降低转染效率。因此，在转染过程中需要选择合适的培养基成分。
