一、污染防控措施
在执行PCR操作时，操作人员需严格遵循既定规程，以最大化减少乃至消除PCR过程中的污染风险。
01
操作区域划分：
尽管当前常规PCR操作难以实现全程单人单管的完全封闭作业，但无论条件如何，均须确保实验在三个独立区域内分阶段完成，且PCR的前处理与后处理需严格隔离：
样本制备区：专用于扩增模板的准备工作；
PCR扩增区：涵盖反应体系的配制及PCR扩增过程；
产物分析区：负责凝胶电泳分析、产物成像及重组克隆的操作。
各工作区域应保持适度隔离，使用专用操作工具，并遵循明确的工作流程方向，即：样本制备 → PCR扩增 → 产物分析 → 产物处置。
重要提示：严禁将产物分析区的任何产物或器材带入其他两个工作区域，以防交叉污染。
02
试剂配置与分装规范：
PCR扩增所需全部试剂均需在配备紫外灯的超净工作台或负压工作台内完成配制与分装操作。此区域内，加样器与吸头需定点存放，且专用于试剂处理，严禁用于吸取已完成扩增的DNA样本或任何其他来源的DNA材料：
1）PCR用水标准：必须采用经过高压灭菌处理的双蒸水，以确保实验用水的纯净无污染。
2）引物与dNTP准备：其配制过程需在无PCR扩增产物污染的区域进行，同样使用高压灭菌的双蒸水作为溶剂。
3）分装与标识：引物与dNTP需分别进行小份量分装储存，每份分装时均需详细标注分装日期，此举有助于在发生污染时迅速追溯问题源头，便于后续分析与处理。
03
实验操作规范要点
扩增序列的残留污染常导致假阳性结果，而样品间的交叉污染同样不容忽视。因此，从样品收集、抽提到扩增的全过程，均需保持高度警惕与严谨态度：
个人防护：佩戴一次性手套，一旦反应液意外溅到手套上，需立即更换，以防污染扩散。
吸头使用规范：采用一次性吸头，并严格区分PCR产物分析室所用吸头，避免混用。吸头不应长时间暴露于空气中，以减少气溶胶污染的风险。
防飞溅措施：开启反应管前，先通过轻微离心使液体聚集于管底，防止反应液飞溅。若不慎溅出，需立即更换手套，并用稀酸溶液清洁污染区域。
高效混合与分装：在处理多份样品时，预先将dNTP、缓冲液、引物及酶混合均匀，再行分装。此操作不仅简化了流程，降低了污染风险，还提高了反应的精确度。
模板添加时机：在所有反应成分混合均匀后，最后加入模板DNA，并立即盖紧反应管，确保反应体系的密封性。
对照设置：设立阴阳性对照及空白对照，既验证了PCR反应的可靠性，也评估了扩增系统的稳定性与可信度。
加样器管理：优先选用可替换或可高压灭菌的加样器，因其易受产物气溶胶或样本DNA污染。若条件所限，至少应确保PCR操作过程中加样器的专用性，特别是PCR产物分析所用的加样器，严禁带入其他区域。
结果验证：通过重复实验验证结果，谨慎得出结论，确保实验数据的准确性与可靠性。
二、污染源追踪策略
面对污染情况，需采取系统性方法逐一排查并消除污染源。
01实施对照实验：
为确保反应体系各组分未被污染，应设立对照实验。阳性对照应选择扩增信号较弱但重复性良好的样本，避免使用强阳性对照，因其可能产生大量非必要的扩增序列，反而成为潜在的污染源。
如果采用含靶序列的重组质粒作为对照，仅需100个拷贝以内的靶序列即可实现阳性扩增。阴性对照的选择同样需谨慎，鉴于PCR技术的高度敏感性，即便通过其他方法（如Southern印迹或点杂交）检测为阴性的样本，也可能含有极微量的靶分子。
此外，每次扩增实验均应包含PCR体系中各试剂的时机对照，即包含除模板DNA外的所有反应成分，以有效监测试剂中是否存在PCR产物残留污染。若试剂对照呈现阳性结果，则表明一种或多种试剂已被污染。此时，应立即更换全新试剂，并设置不同反应管，每管仅含一种待检试剂，以便快速定位并处理污染试剂。
02环境污染考量：
当试剂污染被排除，且在更换新试剂后不久再次发现污染迹象时，若预防措施已相当严格，则需将注意力转向可能的环境污染。
环境污染的常见源头包括但不限于：
1. 模板提取过程中使用的真空抽干装置；
2. 凝胶电泳所用的加样器；
3. 电泳设备本身；
4. 紫外分析仪的操作区域；
5. 切胶用的刀具或手术刀片；
6. 离心机的内部及外部接触面；
7. 冰箱门把手、冷冻架、实验台面等高频接触点。
为有效识别潜在污染源，可采用擦拭实验进行筛查：
1）使用无菌水浸润并灭菌的棉签，轻轻擦拭疑似污染区域；
2）将棉签浸入0.1ml去离子水中，充分溶解可能沾染的污染物；
3）取此溶液5ml进行PCR扩增实验；
4）通过电泳分析扩增结果，以检测是否存在污染。
8. 如果上述追踪实验均未能锁定确切污染源，则需考虑污染可能源自空气中悬浮的PCR产物气溶胶。最彻底的解决方案是更换实验场所。若条件受限，无法更换场所，则应设计并采用与原引物无关联的新引物，以规避潜在的气溶胶污染风险。
三、污染应对策略01针对环境污染的处理措施
1）稀酸处理：对疑似受污染的器具，可采用1mol/L的盐酸进行擦拭或浸泡处理，此操作能有效使残余DNA发生脱嘌呤反应，从而降低污染风险。
2）紫外照射（UV）消毒：通常选用254/300nm波长的紫外线，照射时长为30分钟。但需注意，UV照射在消除残留PCR产物污染方面的效果，受PCR产物长度及碱基分布的影响显著。
该方法主要对500bp以上的长片段DNA有效，对短片段DNA的污染消除作用有限。在UV照射下，PCR产物中的嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体会导致DNA延伸终止。但并非所有嘧啶碱基都能形成二聚体，且UV照射还可能导致二聚体断裂。
二聚体的形成程度及类型，以及与之相邻的核苷酸序列，均受UV波长的影响。在受照射的长DNA链上，二聚体缺陷的形成频率低于0.065/碱基，而其他非二聚体的光照损伤（例如环丁烷型嘧啶复合体、胸腺嘧啶乙二醇、DNA链间与链内的交联及DNA断裂等）同样能终止Taq DNA聚合酶的延伸。
这些损伤位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，则一个500bp的DNA片段上将有约32处损伤位点，使得在105个拷贝分子中，会有许多分子未受任何损伤。这正是UV照射在消除污染时存在片段长度限制的根本原因。
02应对反应液污染的策略
针对反应液污染问题，可采取以下措施进行处理：
DNase I处理法：在PCR混合液（注意此时尚未加入模板DNA和Taq聚合酶）中加入0.5U的DNase I，于室温条件下反应30分钟，随后加热以灭活DNase I。之后，再加入模板DNA和Taq聚合酶，按常规流程进行PCR扩增。此方法的优势在于，无需了解污染DNA的具体序列信息。
内切酶处理法：选取能识别4个碱基的内切酶（例如Msp I和Taq I等），并可考虑同时使用多种酶，以克服单一酶识别序列的局限性。在室温下作用1小时后，加热灭活内切酶，再进行PCR扩增。
紫外照射处理法：对于尚未加入模板DNA和Taq聚合酶的PCR混合液，可采用紫外照射进行处理。具体注意事项和操作方法与前述的UV照射法相同。
γ射线辐射法：利用γ射线进行辐射处理，1.5kGy的辐射剂量足以完全破坏0.1ng的基因组DNA，而2.0kGy的剂量则可破坏10^4拷贝的质粒分子。值得注意的是，4.0kGy的剂量虽然仍不会影响PCR过程，但超过此限度则会导致PCR扩增效率降低。引物即使经过γ射线照射，也不会影响PCR反应。γ射线主要通过使水离子化产生自由基，进而破坏DNA结构。
在执行PCR操作时，操作人员需严格遵循既定规程，以最大化减少乃至消除PCR过程中的污染风险。
01
操作区域划分：
尽管当前常规PCR操作难以实现全程单人单管的完全封闭作业，但无论条件如何，均须确保实验在三个独立区域内分阶段完成，且PCR的前处理与后处理需严格隔离：
样本制备区：专用于扩增模板的准备工作；
PCR扩增区：涵盖反应体系的配制及PCR扩增过程；
产物分析区：负责凝胶电泳分析、产物成像及重组克隆的操作。
各工作区域应保持适度隔离，使用专用操作工具，并遵循明确的工作流程方向，即：样本制备 → PCR扩增 → 产物分析 → 产物处置。
重要提示：严禁将产物分析区的任何产物或器材带入其他两个工作区域，以防交叉污染。
02
试剂配置与分装规范：
PCR扩增所需全部试剂均需在配备紫外灯的超净工作台或负压工作台内完成配制与分装操作。此区域内，加样器与吸头需定点存放，且专用于试剂处理，严禁用于吸取已完成扩增的DNA样本或任何其他来源的DNA材料：
1）PCR用水标准：必须采用经过高压灭菌处理的双蒸水，以确保实验用水的纯净无污染。
2）引物与dNTP准备：其配制过程需在无PCR扩增产物污染的区域进行，同样使用高压灭菌的双蒸水作为溶剂。
3）分装与标识：引物与dNTP需分别进行小份量分装储存，每份分装时均需详细标注分装日期，此举有助于在发生污染时迅速追溯问题源头，便于后续分析与处理。
03
实验操作规范要点
扩增序列的残留污染常导致假阳性结果，而样品间的交叉污染同样不容忽视。因此，从样品收集、抽提到扩增的全过程，均需保持高度警惕与严谨态度：
个人防护：佩戴一次性手套，一旦反应液意外溅到手套上，需立即更换，以防污染扩散。
吸头使用规范：采用一次性吸头，并严格区分PCR产物分析室所用吸头，避免混用。吸头不应长时间暴露于空气中，以减少气溶胶污染的风险。
防飞溅措施：开启反应管前，先通过轻微离心使液体聚集于管底，防止反应液飞溅。若不慎溅出，需立即更换手套，并用稀酸溶液清洁污染区域。
高效混合与分装：在处理多份样品时，预先将dNTP、缓冲液、引物及酶混合均匀，再行分装。此操作不仅简化了流程，降低了污染风险，还提高了反应的精确度。
模板添加时机：在所有反应成分混合均匀后，最后加入模板DNA，并立即盖紧反应管，确保反应体系的密封性。
对照设置：设立阴阳性对照及空白对照，既验证了PCR反应的可靠性，也评估了扩增系统的稳定性与可信度。
加样器管理：优先选用可替换或可高压灭菌的加样器，因其易受产物气溶胶或样本DNA污染。若条件所限，至少应确保PCR操作过程中加样器的专用性，特别是PCR产物分析所用的加样器，严禁带入其他区域。
结果验证：通过重复实验验证结果，谨慎得出结论，确保实验数据的准确性与可靠性。
二、污染源追踪策略
面对污染情况，需采取系统性方法逐一排查并消除污染源。
01实施对照实验：
为确保反应体系各组分未被污染，应设立对照实验。阳性对照应选择扩增信号较弱但重复性良好的样本，避免使用强阳性对照，因其可能产生大量非必要的扩增序列，反而成为潜在的污染源。
如果采用含靶序列的重组质粒作为对照，仅需100个拷贝以内的靶序列即可实现阳性扩增。阴性对照的选择同样需谨慎，鉴于PCR技术的高度敏感性，即便通过其他方法（如Southern印迹或点杂交）检测为阴性的样本，也可能含有极微量的靶分子。
此外，每次扩增实验均应包含PCR体系中各试剂的时机对照，即包含除模板DNA外的所有反应成分，以有效监测试剂中是否存在PCR产物残留污染。若试剂对照呈现阳性结果，则表明一种或多种试剂已被污染。此时，应立即更换全新试剂，并设置不同反应管，每管仅含一种待检试剂，以便快速定位并处理污染试剂。
02环境污染考量：
当试剂污染被排除，且在更换新试剂后不久再次发现污染迹象时，若预防措施已相当严格，则需将注意力转向可能的环境污染。
环境污染的常见源头包括但不限于：
1. 模板提取过程中使用的真空抽干装置；
2. 凝胶电泳所用的加样器；
3. 电泳设备本身；
4. 紫外分析仪的操作区域；
5. 切胶用的刀具或手术刀片；
6. 离心机的内部及外部接触面；
7. 冰箱门把手、冷冻架、实验台面等高频接触点。
为有效识别潜在污染源，可采用擦拭实验进行筛查：
1）使用无菌水浸润并灭菌的棉签，轻轻擦拭疑似污染区域；
2）将棉签浸入0.1ml去离子水中，充分溶解可能沾染的污染物；
3）取此溶液5ml进行PCR扩增实验；
4）通过电泳分析扩增结果，以检测是否存在污染。
8. 如果上述追踪实验均未能锁定确切污染源，则需考虑污染可能源自空气中悬浮的PCR产物气溶胶。最彻底的解决方案是更换实验场所。若条件受限，无法更换场所，则应设计并采用与原引物无关联的新引物，以规避潜在的气溶胶污染风险。
三、污染应对策略01针对环境污染的处理措施
1）稀酸处理：对疑似受污染的器具，可采用1mol/L的盐酸进行擦拭或浸泡处理，此操作能有效使残余DNA发生脱嘌呤反应，从而降低污染风险。
2）紫外照射（UV）消毒：通常选用254/300nm波长的紫外线，照射时长为30分钟。但需注意，UV照射在消除残留PCR产物污染方面的效果，受PCR产物长度及碱基分布的影响显著。
该方法主要对500bp以上的长片段DNA有效，对短片段DNA的污染消除作用有限。在UV照射下，PCR产物中的嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体会导致DNA延伸终止。但并非所有嘧啶碱基都能形成二聚体，且UV照射还可能导致二聚体断裂。
二聚体的形成程度及类型，以及与之相邻的核苷酸序列，均受UV波长的影响。在受照射的长DNA链上，二聚体缺陷的形成频率低于0.065/碱基，而其他非二聚体的光照损伤（例如环丁烷型嘧啶复合体、胸腺嘧啶乙二醇、DNA链间与链内的交联及DNA断裂等）同样能终止Taq DNA聚合酶的延伸。
这些损伤位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，则一个500bp的DNA片段上将有约32处损伤位点，使得在105个拷贝分子中，会有许多分子未受任何损伤。这正是UV照射在消除污染时存在片段长度限制的根本原因。
02应对反应液污染的策略
针对反应液污染问题，可采取以下措施进行处理：
DNase I处理法：在PCR混合液（注意此时尚未加入模板DNA和Taq聚合酶）中加入0.5U的DNase I，于室温条件下反应30分钟，随后加热以灭活DNase I。之后，再加入模板DNA和Taq聚合酶，按常规流程进行PCR扩增。此方法的优势在于，无需了解污染DNA的具体序列信息。
内切酶处理法：选取能识别4个碱基的内切酶（例如Msp I和Taq I等），并可考虑同时使用多种酶，以克服单一酶识别序列的局限性。在室温下作用1小时后，加热灭活内切酶，再进行PCR扩增。
紫外照射处理法：对于尚未加入模板DNA和Taq聚合酶的PCR混合液，可采用紫外照射进行处理。具体注意事项和操作方法与前述的UV照射法相同。
γ射线辐射法：利用γ射线进行辐射处理，1.5kGy的辐射剂量足以完全破坏0.1ng的基因组DNA，而2.0kGy的剂量则可破坏10^4拷贝的质粒分子。值得注意的是，4.0kGy的剂量虽然仍不会影响PCR过程，但超过此限度则会导致PCR扩增效率降低。引物即使经过γ射线照射，也不会影响PCR反应。γ射线主要通过使水离子化产生自由基，进而破坏DNA结构。
