WB 技术颇具挑战性，尤其是磷酸化蛋白的 WB 检测，更是困难重重！这是因为细胞裂解后，蛋白酶和磷酸酶会被释放出来，它们可能会降解或修饰蛋白质，进而对检测结果产生影响。那么，我们该如何应对呢？
首先看下磷酸化蛋白的作用都有哪些？
细胞信号传导研究：检测激酶活性和磷酸化蛋白的变化，研究细胞内信号通路的激活或抑制。
疾病机制研究：例如，在癌症研究中，磷酸化蛋白的异常变化可能与肿瘤发生、发展和转移相关。
药物研发：检测药物处理后磷酸化蛋白的变化，评估药物的作用靶点和效果。
发育生物学：研究胚胎发育过程中磷酸化蛋白的调控，了解细胞分化和器官形成的机制。
应激响应：观察细胞在应激条件下（如氧化应激、缺氧等）磷酸化蛋白的变化，研究应激适应机制。
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在 Western blot 实验中检测磷酸化蛋白时，需要注意以下几点：
1. 样本处理：
在细胞裂解过程中，蛋白酶和磷酸酶会被释放出来，可能会影响检测结果。为了防止蛋白降解或修饰，可以将样本置于冰上，并使用预冷的缓冲液。同时，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂也是非常必要的。
2.样本上量
磷酸化蛋白的丰度通常较低，大概只有总蛋白量的10%，甚至更低，这可能会导致在 Western blot 实验中检测到的信号较弱。为了获得清晰的磷酸化条带，增加每个孔上的蛋白量是一个常见的策略。
3. 检测总蛋白含量
为确定 WB 上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。
4. 抗体选择：
选择针对磷酸化蛋白的特异性抗体，并确保其质量和适用性。抗体的稀释倍数也需要适当调整，以确保最佳的检测效果。
5. 封闭剂选择：
避免使用牛奶作为封闭剂，因为牛奶中含有大量的磷酸化酪蛋白，可能会影响磷酸化抗体对靶蛋白的结合。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。
6.检测条件优化：
根据实验需求和蛋白特性，选择合适的底物进行化学发光检测，并优化孵育时间和检测条件，以获得最佳的检测结果。
7. 结果分析：
在分析 Western blot 结果时，需要注意特异性和非特异性条带的识别。磷酸化蛋白 Western blot 实验中常常会出现非特异性的条带，需要通过与对照组的比较来进行分析和判断。
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首先看下磷酸化蛋白的作用都有哪些？
细胞信号传导研究：检测激酶活性和磷酸化蛋白的变化，研究细胞内信号通路的激活或抑制。
疾病机制研究：例如，在癌症研究中，磷酸化蛋白的异常变化可能与肿瘤发生、发展和转移相关。
药物研发：检测药物处理后磷酸化蛋白的变化，评估药物的作用靶点和效果。
发育生物学：研究胚胎发育过程中磷酸化蛋白的调控，了解细胞分化和器官形成的机制。
应激响应：观察细胞在应激条件下（如氧化应激、缺氧等）磷酸化蛋白的变化，研究应激适应机制。
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在 Western blot 实验中检测磷酸化蛋白时，需要注意以下几点：
1. 样本处理：
在细胞裂解过程中，蛋白酶和磷酸酶会被释放出来，可能会影响检测结果。为了防止蛋白降解或修饰，可以将样本置于冰上，并使用预冷的缓冲液。同时，在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂也是非常必要的。
2.样本上量
磷酸化蛋白的丰度通常较低，大概只有总蛋白量的10%，甚至更低，这可能会导致在 Western blot 实验中检测到的信号较弱。为了获得清晰的磷酸化条带，增加每个孔上的蛋白量是一个常见的策略。
3. 检测总蛋白含量
为确定 WB 上信号的缺失是由于磷酸化效率低还是磷酸化蛋白分离不充分，同时需要检测总蛋白含量。例如，使用配对抗体检测磷酸化和未修饰的蛋白。
4. 抗体选择：
选择针对磷酸化蛋白的特异性抗体，并确保其质量和适用性。抗体的稀释倍数也需要适当调整，以确保最佳的检测效果。
5. 封闭剂选择：
避免使用牛奶作为封闭剂，因为牛奶中含有大量的磷酸化酪蛋白，可能会影响磷酸化抗体对靶蛋白的结合。建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。
6.检测条件优化：
根据实验需求和蛋白特性，选择合适的底物进行化学发光检测，并优化孵育时间和检测条件，以获得最佳的检测结果。
7. 结果分析：
在分析 Western blot 结果时，需要注意特异性和非特异性条带的识别。磷酸化蛋白 Western blot 实验中常常会出现非特异性的条带，需要通过与对照组的比较来进行分析和判断。
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